SUMÁRIO
APRESENTAÇÃO 3
MICROSCÓPIO DE LUZ 4
PRÁTICA N01 8
Focalização de uma letra de jornal 8
Material: Letras de jornal. 8
PRÁTICA N02 10
Células de cortiça 10
Material: Rolha de cortiça. 10
PRÁTICA N03 11
Célula procariótica - cianobactéria 11
Material: Cultura de cianobactérias. 11
PRÁTICA N04 13
Célula procariótica – bactéria do iogurte 13
Material: Iogurte. 13
PRÁTICA N05 14
Célula procariótica – bactérias da cavidade oral 14
Material: Mucosa oral. 14
PRÁTICA N06 15
Célula eucariótica animal –mucosa oral 15
Material: Mucosa oral 15
PRÁTICA N07 17
Célula eucariótica vegetal - Allium cepa 17
Material: Allium cepa 17
PRÁTICA N08 17
Célula eucariótica vegetal - Elodea sp. 17
prática n09 17
Célula eucariótica vegetal - Tradescantia sp. 17
PRÁTICA N10 17
Célula eucariótica - protozoários 17
Material: Cultura de protozoários. 17
PRÁTICA N11 17
Célula eucariótica - levedura 17
Material: Fermento de pão. 17
PRÁTICA N12 17
Paramecium spp - organismo unicelular 17
Material: Cultura pura de ciliados (Paramecium spp). 17
PRÁTICA N13 17
Membrana plasmática 17
Material: Allium cepa. 17
PRÁTICA N14 17
Membrana plasmática 17
O SANGUE É COMPOSTO 17
Material: Sangue. 17
PRÁTICA N15 17
CROMOPLASTOS 17
Material: Epiderme inferior da folha de samambaia. 17
Material: Polpa de tomate. 17
Material: Polpa de pimentão amarelo. 17
PRÁTICA N16 17
Leucoplastos 17
Material: Batata inglesa (Tuberculus tuberosa). 17
PRÁTICA N17 17
Mitocôndrias 17
Material: Sangue. 17
PRÁTICA N18 17
Grânulos citoplasmáticos – movimento intracelular 17
Material: escamas de peixe 17
PRÁTICA N19 17
Cílios e flagelos - Movimentos celulares 17
Material: Espermatozóides. 17
PRÁTICA N20 17
Núcleo células mononucleada e binucleada 17
Material: "imprint" decalque de fígado bovino. 17
PRÁTICA N21 17
Núcleo de Células sangüíneas célula anucleada e polimorfonucleada 17
Material: Sangue humano. 17
PRÁTICA N22 17
Nucléolo 17
Material: Allium cepa 17
PRÁTICA N23 17
Cromossomos politênicos 17
MATERIAL: glândula salivar de Drosophila melanogaster (“mosca das frutas”). 17
PRÁTICA N 24 17
Cromatina sexual ou corpúsculo de Barr 17
MATERIAL: células da mucosa bucal 17
PRÁTICA N25 17
Divisão celular – mitose 17
PRÁTICA N 26 17
Divisão celular - meiose 17
MATERIAL: florescência masculina de milho 17
Obs.: a fase de leptóteno não é observada. 17
PRÁTICA N27 17
Extração de DNA 17
Material: Allium cepa 17
UTILIZAÇÃO DO DNA 17
CORANTES E REAGENTES 17
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA 17
APRESENTAÇÃO
"Ominis cellula e cellula"
Rudolf Virchow
A biologia representa o entendimento do mundo vivo, em todos os seus níveis hierárquicos, da base molecular às complexas interações ecológicas nos ecossistemas. Dentro desta área do conhecimento humano, a biologia celular abrange o entendimento da unidade morfológica e funcional dos seres vivos, a célula - sua origem, evolução, função e organização -, combinando métodos e informações de um vasto campo dentro da ciência.
Enquanto ramo dinâmico da biologia, os conhecimentos da estrutura e funcionamento da célula estiveram e, ainda estão, atrelados ao desenvolvimento e aplicação de uma série de técnicas bioquímicas e microscópicas, e cujos conhecimentos são básicos na formação dos profissionais ligados à área de Ciências Biológicas e da Saúde. A difusão das informações, advinda do emprego destas técnicas, deve ser repassada de uma forma didática, tanto aos acadêmicos do ensino superior, quanto aos profissionais ligados à área educacional. Neste sentido, o uso de esquemas didático-pedagógicos, fotomicrografias, eletromicrografias e experiências são fundamentais no entendimento da função celular. As práticas de biologia celular aplicadas, principalmente, nos cursos de graduação, pós-graduação e, também, como parte do conteúdo programático no ensino médio são importantes no processo de aprendizagem do aluno.
Assim, na elaboração do presente livro, que representa um roteiro para as aulas práticas de Biologia Celular, a grande preocupação foi a de facilitar a execução das atividades experimentais. Neste sentido, as metodologias são detalhadas passo-a-passo, da mesma forma que o modo de preparo dos reagentes e corantes. Apesar de haver literaturas específicas para este fim, sua reunião em uma única obra, sem dúvida facilitará o trabalho do educador e o aprendizado do aluno.
Ressalta-se que as práticas foram montadas e adaptadas tendo por base vários textos disponíveis em forma de livros e apostilas, de modo a atender às necessidades da disciplina de Biologia Celular oferecida na UNIOESTE.
O livro inicia com uma explicação sobre o nosso principal aliado: o microscópio de luz; cujo texto descreve suas principais partes, e traz conceitos fundamentais necessários à otimização de sua utilização. Os roteiros das aulas práticas apresentam inicialmente alguns pressupostos teóricos, cujo aprofundamento deve ser efetuado pelo próprio professor, em função de suas necessidades metodológicas. Como parte do aprendizado de aula prática o aluno representa, na própria folha do roteiro, o material que está sendo observado. Na última parte do livro o leitor encontrará o modo de preparo dos reagentes e o detalhamento necessário para preparar as soluções utilizadas.
A organização dos conteúdos apresentados neste livro visa atender às necessidades do aluno no processo ensino-aprendizagem, as quais permitirão que o mesmo se torne um indivíduo com subsídios adicionais na sua competência profissional e social.
Os Autores.
MICROSCÓPIO DE LUZ
O órgão sensorial humano especializado na visão é o olho, cujas células fotorreceptoras são capazes de perceber a luz. Contudo, apenas a faixa da luz visível, do espectro da radiação eletromagnética, é capaz de sensibilizar estas células. Da mesma forma, a acuidade visual humana apresenta limites, ou seja, conseguimos enxergar objetos, se os mesmos estiverem a uma distância mínima de 0,25 mm. Imagens de objetos extremamente diminutos, como da maioria das células, não são distinguidas pelo olho humano.
Para suplantarmos os limites sensoriais da visão, precisamos recorrer a um instrumento, o MICROSCÓPIO (do grego micron = pequeno e scopein = examinar). Percebe-se, com isso, que seria impossível ao homem conhecer a CÉLULA, se não tivesse sido inventado o microscópio, que possibilita a formação de uma imagem ampliada.
Existem vários tipos de microscópios, mas nos ateremos ao estudo do microscópio de luz ou fotônico que fornece uma imagem aumentada e, geralmente, invertida da esquerda para a direita (devido à associação de lentes) dos objetos em observação. Apesar da grande variabilidade externa dos microscópios, seus componentes fundamentais são sempre os mesmos (figura 1). O microscópio de luz é composto de partes mecânica e óptica.
A. PARTE MECÂNICA:
• Base, suporte ou pé- sustenta todo o conjunto do microscópio, pode ser retangular ou oval;
• Braço, coluna ou estativa- articula-se com a base, sustentando o tubo do microscópio, onde se encontram as lentes;
• Canhão ou tubo- permite a comunicação entre a ocular e a objetiva e abriga um prisma;
• Platina- mesa em miniatura que apresenta um orifício central para a passagem da luz, é o local onde se coloca a lâmina que fica presa por meio de pinças ou garras. O deslocamento da lâmina na platina é efetuado pelo charriot (sistema de botões de deslizamento). A platina também apresenta um sistema de escalas;
• Revólver ou porta-objetiva giratória- peça giratória do tubo que permite a troca e fixação das objetivas;
• Parafuso macrométrico- botão giratório que permite movimentos mais amplos da platina em direção às objetivas ou vice-versa, localiza-se lateralmente na coluna do microscópio;
• Parafuso micrométrico- botão giratório que permite movimentos mais delicados da platina em direção às objetivas ou vice-versa, utilizado para a focalização final do objeto. Localizado próximo ao macrométrico ou acoplado a ele. Em certos microscópios só há um parafuso, representando macro e micrométrico;
• Parafuso condensador- localizado na porção inferior da coluna, serve para abaixar e levantar o condensador.
B. PARTE ÓPTICA, composta por um conjunto de lentes e meios transparentes que servem para conduzir o feixe luminoso.
B1. SISTEMA ÓPTICO DE ILUMINAÇÃO
• Fonte de luz- na base do microscópio;
• Diafragma-íris- regula a intensidade do feixe luminoso que chega ao objeto, possibilitando maior nitidez da imagem;
• Condensador- é um conjunto de lentes situado abaixo da platina, concentra e fornece a luz necessária à iluminação do objeto em estudo. Ao concentrar os raios luminosos, aumenta a quantidade de luz que atravessa o objeto;
• Filtros- normalmente de vidro colorido, servem para absorver parte do espectro de radiações luminosas, permitindo utilizar faixas estreitas de comprimentos de ondas selecionados.
B2. SISTEMA ÓPTICO DE OBSERVAÇÃO
• Lentes oculares- sistema de lentes próximas ao olho do observador. Aumenta a imagem do objeto, que já vem aumentada pelas objetivas. As oculares são formadas por duas lentes, a superior (ocular) e a inferior (lente de campo ou colérica). As lentes oculares trazem inscrições que dão sua característica, por exemplo: 8x Kpl, significa ocular com poder de aumentar 8 vezes e Kpl, Kompens Plan, indica a especificação corrigida para campos de visão maiores e planos;
• Lentes objetivas- situadas próximas ao objeto formam uma imagem real e invertida do mesmo. Existem vários tipos de objetivas: acromática; fluorita; planacromática; apocromática; planapocromática. As objetivas trazem inscrições que especificam suas características, por exemplo:
Plan= planocromática. Isto é: objetiva com imagem plana e correções cromáticas e de curvatura ou esfericidade;
16= aumento de 16 X;
0,32= valor da abertura numérica (AN), que indica a capacidade da objetiva em captar luz e fornecer detalhes da amostra a uma determinada distância;
160= comprimento mecânico do tubo do microscópio em mm, é a distância do local de encaixe da objetiva até a ocular;
0,17= distância de trabalho (mm) entre a lente objetiva e a superfície da lâmina, quando a mostra está em foco.
São chamadas objetivas à seco, aquelas que entre o objeto (examinado na lâmina) e a objetiva existe o ar. As objetivas de imersão são as que, neste meio, se coloca um óleo transparente (de cedro ou sucedâneo sintético), de índice de refração o mais próximo possível da lente, cuja finalidade é tornar mais claro o campo do microscópio. As objetivas de 100x são sempre de imersão. e são geralmente marcadas com anéis coloridos.
objetiva a seco objetiva de imersão
ar
lamínula
PODER DE RESOLUÇÃO (PR)- capacidade de um sistema óptico de produzir uma imagem nítida. O olho humano tem poder de resolução de aproximadamente 100 µm, enquanto que os microscópios de luz comuns, em torno de 0,2 m.
LIMITE DE RESOLUÇÃO (LR)- refere-se a menor distância que deve existir entre dois pontos para que apareçam individualizados na imagem. O LR já é determinado na fabricação do equipamento e pode ser calculado pela fórmula:
k= constante 0,61
= comprimento de onda da luz empregada (luz branca = 0,55m)
AN= abertura numérica da lente em uso (vem gravado nas objetivas); expressa uma relação matemática entre o LR e a capacidade de captar a luz da objetiva.
Exemplo: Dois pontos A• •B , estão separados por uma distância de 0,3 m. Num sistema óptico com LR de 0,2 m, A e B aparecem separados; porém num sistema óptico com LR de 0,5 m, os pontos A e B aparecem fundidos. Quanto menor for o LR, maior a sua capacidade de evidenciar detalhes e, portanto, maior seu PR.
AUMENTO DO MICROSCÓPIO - o aumento total do microscópio é obtido multiplicando-se o aumento da ocular pelo aumento da objetiva. Assim, uma objetiva de 4X e uma ocular de 10X possibilitam uma imagem aumentada em 40X.
Figura 1 - Legenda: 1-Ocular; 2-Ajuste da distância interpupilar; 3-Revólver porta-objetivas; 4-Objetivas; 5-Platina; 6- Condensador; 7-Diafragma de abertura; 8-Porta-filtro (tipo encaixe); 9-Trava mecânica para pré-focalização e proteção da lâmina; 10-Ajuste vertical do condensador; 11-Base; 12-Correção dióptrica e ajuste da parafocalidade; 13-Tubo de observação; 14-Trava do tubo de observação; 15-Estativa; 16-Charriot; 17-Garra de lâmina; 18-Anel de ajuste da tensão; 19-Ajuste macrométrico; 20-Ajuste micrométrico (graduado em 2,5µm); 21-Controles coaxiais do Charriot; 22-Controle deslizante para variação de intensidade de luz; 23-Interruptor.
Prática n01. FOCALIZAÇÃO DE UMA LETRA DE JORNAL
Para se estudar um objeto ao microscópio de luz é necessário que o estudante saiba os princípios básicos de seu funcionamento. A letra de jornal é amplamente empregada no treinamento prático com o microscópio, facilitando o conhecimento das etapas necessárias à focalização, uma vez que o objeto da imagem é conhecido.
Material de observação: Letras de jornal.
Objetivo: Treinar o uso do microscópio de luz, aprendendo as etapas necessárias para focalização de um material.
Método:
1. Recortar uma letra pequena de jornal;
2. Colocar uma gota de água sobre a lâmina, com auxílio de um conta-gotas ou pipeta;
3. Colocar a letra de jornal (na posição de leitura) sobre a gota de água;
4. Colocar a lamínula em posição de 45 para evitar a formação de bolhas. Caso haja excesso de líquido, retira-lo com auxílio de papel absorvente, para manter a lamínula fixa;
5. Seguir as etapas da colocação da lâmina no microscópio e focalização do material em estudo:
a. Colocar a lâmina pronta (com a lamínula voltada para cima) sobre a platina do microscópio, e fixá-la com a pinça;
b. Centralizar a letra de jornal sobre o orifício na platina, utilizando o charriot;
c. Observar o material com a objetiva de menor aumento, 4X;
d. Posicionar corretamente a objetiva de 4X no eixo óptico, encaixando-a com o revólver;
e. Levantar a platina na sua altura máxima, girando o parafuso macrométrico;
f. Ligar o microscópio e verificar se a luz atravessa o orifício na platina, caso contrário abrir o diafragma-íris;
g. Olhar através das oculares e abaixar lentamente a platina, com o parafuso macrométrico, até que a letra de jornal apareça focalizada;
h. Proceder à focalização final com ajustes no parafuso micrométrico;
i. Ajustar a distância interpupilar, segurando nas bordas laterais da parte deslizante no tubo;
j. Regular o feixe luminoso, utilizando os controles de variação da intensidade de luz e o diafragma-íris, que melhoram a nitidez na imagem do material em estudo;
k. Analisar todo o material preparado, movimentando a lâmina com o charriot, e escolher um campo de interesse para os esquemas a serem realizados;
l. Transferir para a objetiva de 10X, utilizando o revólver, novamente ajustar o foco da imagem, com os parafusos macrométrico e micrométrico, e regular o feixe luminoso, se necessário;
m. Transferir para a objetiva de 40X, ajustar o foco da imagem utilizando somente o parafuso micrométrico, e novamente regular o feixe luminoso, se necessário;
n. Analisar agora a letra de jornal na objetiva de imersão, 100X. Neste caso, deslocar a objetiva de 40X, na metade da distância entre esta objetiva e a de 100X. Pingar uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina; encaixar a objetiva de 100X; ajustar delicadamente o foco da imagem utilizando o parafuso micrométrico, e regular o feixe luminoso.
6. Esquematizar a letra, a olho nu e em cada aumento analisado;
7. Ao terminar as observações proceder a retirada do material analisado:
a. Desligar a luz do microscópio;
b. Transferir para a objetiva de menor aumento;
c. Abaixar a platina e retirar a lâmina;
d. Limpar a objetiva de imersão com um lenço de papel ou gaze, umedecida com pequena quantidade da solução de álcool e éter (3:7);
e. Retirar o fio do microscópio da tomada e colocar sobre a mesa.
Analisar/Observar?:
• Inversão da imagem da letra de jornal;
• Textura do papel, onde se pode observar o arranjo das fibras de celulose, nos aumentos sucessivos.
Discussão/Notas??:
• As etapas descritas acima para a focalização de materiais, a serem visualizados em microscopia de luz, devem ser seguidas na íntegra. Desta forma, se evita a quebra lâminas ou o dano ao equipamento.
• Quando usar a objetiva de imersão (100X) não voltar para a objetiva de 40X (objetiva a seco), pois esta ficará suja com o óleo. Assim, após a análise com a objetiva de imersão passar para a objetiva de menor aumento (4X), que não se encosta à lamínula e, portanto, não suja. Caso deseje observar novamente a mesma lâmina, esta deve ser limpa com a mesma solução utilizada para limpeza da objetiva de imersão. Contudo, ressalta-se que no caso de lâminas temporárias, onde a lamínula não se encontra firmemente fixa na lâmina (como a da letra de jornal), esta limpeza é dificultada, uma vez que pode provocar o deslocamento da lamínula e a retirada do material de análise. Neste caso, uma nova lâmina deve ser confeccionada.
• A inversão da imagem da letra de jornal ocorre devido à associação das lentes do microscópio ???.
Prática n02. CÉLULAS DA CORTIÇA
A cortiça ou súber (latim súber = casca de árvore) é um tecido vegetal formado por células mortas, que revestem externamente caules e raízes de plantas que crescem em espessura. A morte celular é o resultado da deposição de suberina na parede celular, que, sendo impermeável, bloqueia o transporte de água e nutrientes para a célula. A cortiça pode ter grande espessura, como ocorre no sobreiro (Quercus suber), árvore cultivada que fornece a cortiça comercial.
Material de observação: Rolha de cortiça.
Objetivo: Conhecer o material que deu origem ao termo “célula”, introduzido por Robert Hook, em 1665.
Método:
1. Pegar uma rolha e corte em fatias bem finas, com auxílio de uma lâmina de barbear afiada;
2. Colocar uma fatia na lâmina com uma gota de água;
3. Colocar a lamínula em posição de 45 para evitar a formação de bolhas;
4. Retirar possível excesso de líquido, com auxílio de papel absorvente, para manter a lamínula fixa;
5. Recortar um outro pedaço, colocar novamente sobre a lâmina, com uma gota de detergente, e cobrir com lamínula;
6. Analisar ao microscópio, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x;
7. Esquematizar nos aumentos de 100x e 400x.
Observar:
• Paredes celulares suberificadas, que representam o contorna das células vegetais mortas.
Prática n03. CÉLULA PROCARIÓTICA - CIANOBACTÉRIA
Ao nível celular os seres vivos presentes na biosfera são divididos em dois tipos de células: procarióticas (pro = primeiro; carion = núcleo), e eucarióticas (eu = verdadeiro). As células procarióticas surgiram primeiro na evolução, cerca de 3,5 bilhões de anos atrás, e apresentam um arranjo estrutural relativamente simples, quando comparado ao das células eucarióticas. No citoplasma está presente o material genético (DNA – ácido desoxirribonucléico), os RNA (ácidos ribonucléicos), os ribossomas, e toda a maquinaria enzimática necessária ao metabolismo celular. Separando o conteúdo citoplasmático do meio extracelular encontra-se a membrana plasmática e a parede bacteriana1. Caracteristicamente, nos procariotos o DNA não apresenta envoltório membranoso, e o local onde é encontrado no citoplasma denomina-se nucleóide (óide = semelhante a).
Os organismos constituídos por células procarióticas são enquadrados no reino Monera, que compreende as bactérias. Este reino se apresenta subdividido em dois grupos: o das arqueobactérias (do grego arche = origem); e o das eubactérias (do grego eu = verdadeiro). As arqueobactérias são pouco conhecidas e vivem em ambientes extremos como fontes termais ácidas, águas salgadas, pântanos, entre outros. Já as eubactérias são mais conhecidas ............, sendo muitas patogênicas ao homem.
Dentre as eubactérias, se destacam as cianobactérias, que habitam o solo úmido ou a água. São organismos autofototróficos, ou seja, utilizam a luz solar para sintetizar seu próprio alimento. Estes organismos se caracterizam pela presença de estruturas membranosas saculiformes no citoplasma celular, onde se fixam os pigmentos fotossintetizantes. Além da clorofila outros tipos de pigmentos estão presentes nas cianobactérias, conferindo-lhes cores características. As cianobactérias podem viver isoladas ou se associarem, formando colônias. Algumas cianobactérias, cujas colônias formam filamentos, apresentam células especializadas na fixação do nitrogênio atmosférico, os heterocistos, utilizados na síntese de aminoácidos.
Material: Cultura de cianobactérias.
Objetivo: Conhecer a morfologia de procariotos.
Método:
1. Preparar com antecedência de 3 a 4 dias uma cultura de bactérias. Para tanto, colocar em um frasco grama com raiz bem picada e 100 mL de água filtrada. Deixar o frasco em local iluminado e arejado, coberto com uma gaze. Este frasco pode ser mantido em laboratório por meses, contanto que não deixe faltar água. Pode-se também obter o material em rios, coletando-se o lodo;
2. Colocar uma gota deste material sobre uma lâmina e cobrir com lamínula;
3. Retirar possível excesso de líquido com auxílio de papel absorvente, para manter a lamínula fixa; Retirar o excesso de líquido com auxílio de papel absorvente, para manter a lamínula fixa; esta não deve ficar escorregando na lâmina
4. Analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x, 40x e 100x;
5. Desenhar/esquematizar?? no/em? maior aumento.
Observar:
• Cianobactérias, identificáveis pelo tamanho diminuto e coloração verde devido à presença dos pigmentos fotossintetizantes em seu citoplasma.
• Cianobactérias isoladas e/ou coloniais;
• Heterocistos se a cultura apresentar colônias com células fixadoras de nirogênio. Estas são células maiores de coloração diferenciada.
Prática n04. CÉLULA PROCARIÓTICA – BACTÉRIA DO IOGURTE
As bactérias do iogurte, principalmente, lactobacilos e estreptococos são eubactérias heterotróficas que obtém energia pelo processo da fermentação láctica (degradação anaeróbica da glicose ou de outros compostos orgânicos para obtenção de energia), onde o produto final é o ácido láctico. Elas fermentam a lactose do leite formando ácido láctico, que se dissocia em lactato e H+ (prótons).O próton acidifica o meio, desnaturando as proteínas do leite, como a caseína, provocando sua desnaturação e, conseqüente, precipitação. Através do processo de fermentação láctica pode se produzir queijo ou iogurte, dependendo do tipo de microrganismo envolvido.
Material: iogurte.
Objetivo: Conhecer a morfologia de procariotos.
Método:
1. Colocar uma gota de iogurte sem sabor sobre uma lâmina;
2. Pingar uma gota de água e homogeneizar com auxílio de um palito de dente;
3. Colocar a lamínula em posição de 45 para evitar a formação de bolhas;
4. Retirar possível excesso de líquido, com auxílio de papel absorvente, para manter a lamínula fixa;
5. Proceder às etapas da focalização e analisar em aumento de 1.000x;
6. Desenhar no maior aumento.
Observar:
• Tipos morfológicos das bactérias do iogurte, como os cocos, os diplococos, os estreptococos e os estafilococos;
• As bactérias são extremamente pequenas, com isso, para facilitar a visualização, abaixar um pouco o condensador do microscópio.
PRÁTICA N05
Célula procariótica – bactérias da cavidade oral
Células procarióticas podem ser identificadas pelo método de coloração de Gram, desenvolvido por Hans Christian Gram, no final do século XIX. Com esta técnica algumas bactérias aparecerão coradas em roxo (Gram-positivas), enquanto outras em vermelho (Gram-negativas). A diferença na coloração é devido aos constituintes de sua parede bacteriana; enquanto as Gram-positivas apresentam uma rica camada de peptidoglicana sobre a membrana plasmática; as Gram-negativas têm paredes mais complexas, formadas pela camada de peptidoglicana (menos espessa), uma camada de lipoproteínas, e a membrana externa.
Na coloração Gram os corantes (cristal violeta e lugol) se combinam com as bactérias na lâmina. A lavagem em álcool (item 6 da metodologia) faz com que algumas bactérias retenham o corante, estas são classificadas como Gram-positivas, e as que perdem a cor são Gram-negativas, ficando incolores. Contudo, para que as Gram-negativas possam ser visualizadas na lâmina, se utiliza o corante fucsina (contracorante), que cora as cora. As Gram-positivas não alteram sua coloração com a fucsina.
A técnica de coloração Gram é muito utilizada em medicina, fornecendo informações para o tratamento de doenças de origem bacteriana. De uma forma geral, as bactérias Gram-positivas são susceptíveis aos antibióticos penicilinas e cefalosporinas; enquanto as Gram-negativas são mais resistentes aos antibióticos.
Material: Mucosa oral.
Objetivo: Conhecer a morfologia de procariotos e executar as etapas de uma coloração diferencial.
Método:
1. Fazer uma raspagem delicada da mucosa na região dorsal da língua ou da bochecha (de baixo para cima), com auxílio de uma espátula de madeira ou palito de dente;
2. Fazer um pequeno e fino esfregaço, do material recolhido na espátula, sobre uma lâmina;
3. Secar sobre a chama de uma lamparina (para fixação);
4. Corar durante 1 minuto com o corante cristal violeta (cora a parede celular);
5. Escorrer o corante e corar com lugol (mordente) por mais 1 minuto;
6. Lavar na solução de álcool 70%: acetona 30% (2:1), escorrendo a solução sobre o esfregaço, até que não saia mais corante, o tempo aproximado é cerca de 15 segundos, pode-se utilizar também álcool 95%. O objetivo é diferenciar o material, pois a lavagem remove a cor púrpura de algumas bactérias e de outras não;
7. Corar com fucsina fenicada, por um período entre 40 segundos a 1 minuto (contracoloração);
8. Lavar em água corrente e secar em temperatura ambiente;
9. Analisar ao microscópio de luz comum com a objetiva de imersão;
10. Desenhar no maior aumento.
Observar:
• bactérias Gram-positivas coram em roxo e Gram-negativas em vermelho. Cabe ressaltar, que muitas vezes não se observa diferenças na coloração, isto porque esta coloração tem os melhores resultados quando as bactérias são jovens (fase de crescimento), e no esfregaço bucal, efetuado durante a aula prática, não se sabe se as bactérias obtidas estão nesta fase.
PRÁTICA N06
Célula eucariótica animal –mucosa oral
As células eucarióticas se caracterizam pela presença de um sistema interno de membranas (sistema de endomembranas), que formam compartimentos funcionais no interior celular. Este sistema compreende o envoltório nuclear, o retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, os lisossomas e uma série de vesículas. Nos compartimentos ocorrem vários processos metabólicos específicos, funcionando como pequenos órgãos (organelas). O sistema de endomembranas aumenta a eficiência da célula eucariótica na execução de suas atividades metabólicas, tornando-a bastante sofisticada e complexa.
O envoltório nuclear delimita um outro compartimento nas células eucarióticas, o núcleo, cujo principal componente é o material genético. que compreende o envoltório nuclear, o material genético e o nucleoplasma O núcleo é de fácil identificação, uma vez que, freqüentemente, se cora de forma distinta do citoplasma. Ressalta-se que a estrutura do envoltório nuclear, bem como a da membrana plasmática só são evidentes na microscopia eletrônica.
Material: Mucosa oral
Objetivos: Conhecer a morfologia de uma célula eucariótica animal; conhecer e analisar as diferenças de três metodologias de preparo de material em microscopia de luz.
Método A:
1. Raspar delicadamente a mucosa oral na região dorsal da língua ou da bochecha (de baixo para cima), com auxílio de uma espátula de madeira ou palito de dente;
2. Fazer um pequeno e fino esfregaço, do material recolhido na espátula, sobre uma lâmina;
3. Deixar a lâmina secar;
4. Analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x, 40x e 100x;
5. Desenhar no aumento de 400x ou 1.000x
Método B:
1. Realizar os mesmos procedimentos de 1 a 3 do método A;
2. Corar o material com azul de metileno ou orceína acética;
3. Cobrir com lamínula em posição de 45 para evitar a formação de bolhas;
4. Retirar o excesso do corante com auxílio de papel absorvente;
5. Colocar esmalte de unha nas bordas da lamínula;
6. Analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x, 40x e 100x;
7. Desenhar no aumento de 400x ou 1.000x.
Método C:
1. Realizar os mesmos procedimentos de 1 a 3 do método A;
2. Antes que o material seque totalmente, fixá-lo em álcool 90%, por 5 minutos;
3. Lavar em água destilada e corar com hematoxilina, por 5 minutos;
4. Lavar em água corrente e corar com eosina, por 3 minutos;
5. Desidratar o material na bateria de álcool etílico (90%, 95%, 100% I, 100% II), por 2 minutos cada;
6. Diafanizar na bateria de xilol (xilol I e II), por 2 minutos cada;
7. Montar utilizando uma resina sintética (bálsamo do Canadá, Permount ou Entelan), deixar secar e analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x, 40x e 100x;
8. Desenhar no aumento de 400x ou 1.000x.
Observar:
• As diferenças nos três métodos de preparação do material, em A - preparação a fresco, o material se mostra transparente, uma vez que as células são formadas principalmente por átomos de baixo peso molecular (carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio) e, por isso, se mostram transparentes; em B – preparação semi-permanente, as células são facilmente identificáveis pelo corante, que se combina as suas estruturas, e a lâmina tem duração temporária, cerca de 24 horas; em C - preparação permanente, nesta técnica a lâmina dura anos, podendo ser utilizada a qualquer momento.
• Núcleo corado em azul escuro, se o corante utilizado for o azul de metileno, ou vermelho escuro se o corante for a orceína acética, ou, ainda, em roxo, se o corante for a hematoxilina;
• Citoplasma acompanha as mesmas cores acima, porém em tons mais claros, exceto quando o corante for a eosina, cujo citoplasma cora-se em rosa;
• Delimitação da célula e o meio extracelular, onde se encontra a membrana plasmática, cuja estrutura só visível em microscopia eletrônica, conforme dito anteriormente.
PRÁTICA N07
Célula eucariótica vegetal - Allium cepa
A célula vegetal caracteriza-se pela presença da parede celular, dos vacúolos, e dos plastos. A parede celular é constituída por polissacarídeos estruturais, principalmente, celulose, hemiceluloses, e pectinas, que conferem rigidez à célula. O vacúolo pode ocupar 95% do volume celular, e apresenta funções diversas, conforme a célula, mas essencialmente participa da manutenção do turgor celular e da rigidez do tecido. Os plastos são organelas maiores que as mitocôndrias, que podem ou não conter pigmentos, denominados, respectivamente, cromoplastos e leucoplastos.
Material: Allium cepa
Método A: lâmina a fresco.
1. Retirar delicadamente um pedaço da epiderme do catáfilo da cebola (de preferência a parte interna);
2. Distender suavemente o material coletado sobre uma lâmina, com auxílio de um pincel molhado em água;
3. Pingar sobre o material distendido uma gota de água;
4. Cobrir com lamínula;
5. Retirar o excesso de líquido com auxílio de papel absorvente;
6. Analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x;
7. Desenhar no aumento de 400x.
Método B: lâmina corada
1. Realizar os mesmos procedimentos 1 e 2 do método A;
2. Pingar sobre o material distendido uma gota de lugol ou cloreto de zinco iodado, corar por 5 minutos;
3. Cobrir com lamínula;
4. Retirar o excesso de líquido com auxílio de papel absorvente;
5. Analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x;
6. Desenhar no aumento de 400x.
Observar:
• As diferenças do material corado e não corado, cuja explicação é fornecida na prática 06;
• Núcleo, citoplasma e parede celular, facilmente identificáveis no material corado.
PRÁTICA N08
Célula eucariótica vegetal - Elodea sp.
Material: Elodea sp.
Método: lâmina a fresco.
1. Colocar uma folha nova de Elodea sobre uma lâmina, já contendo uma gota de água;
2. Retirar o excesso de água com auxílio de papel absorvente;
3. Observar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x;
4. Desenhar no aumento de 40x e 400x.
Observar:
• A morfologia destas células e sua organização na formação do tecido vegetal;
• A profundidade de foco, devido à espessura da folha;
• Presença de cloroplastos, de cor verde, no citoplasma celular;
• O movimento de ciclose dos cloroplastos no citoplasma da célula.
PRÁTICA N09
Célula eucariótica vegetal - Tradescantia sp.
Material: Tradescantia sp.
Método: lâmina a fresco.
1. Retirar uma película da epiderme inferior da folha de Tradescantia, com o auxílio de uma lâmina de barbear;
2. Colocar sobre a lâmina com uma gota de água e cubrir com lamínula;
3. Analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x;
4. Desenhar no aumento de 400x.
Observar:
• Citoplasma, cloroplastos, núcleo e parede celular;
• Estômatos, células-guarda???????
PRÁTICA N10
Célula eucariótica - protozoários
Os Protozoa são organismos eucarióticos unicelulares ou coloniais, que abrangem vários filos, bastante diversos. Esta diversidade é o reflexo de adaptações morfofuncionais que possibilitaram a sobrevivência nos mais variados habitats. Existem espécies parasitas: Trypanosoma cruzi, Leishmania spp., Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Plasmodium spp., Toxoplasma gondii, e também, espécies de vida-livre: Paramecium spp., Vorticella spp., Stentor spp. Para o estudo de protozoários de vida-livre pode-se fazer facilmente uma cultura destes animais, como descrito abaixo.
Material: Cultura de protozoários.
Método:
1. Preparar a cultura de protozoários com antecedência de 3 a 7 dias;
2. Pegar 3 vidros de boca larga (250 mL1), e em cada um colocar:
1º) água destilada ou filtrada + alface picada (1 ou 2 folhas1)
2º) água destilada ou filtrada + fezes secas de galinha (50 g1)
3º) água destilada ou filtrada + capim seco picado (10 folhas1)
Deixar em repouso, com luz do sol indireta e cubra com gaze;
3. Utilizar um conta-gotas ou pipeta para colocar sobre a lâmina uma gota da cultura; cubra com lamínula. Para restringir o movimento dos protozoários pegue uma pequena porção de algodão, abra bem suas fibras formando uma fina película, coloque sobre a lâmina, colocar a gota da cultura e, posteriormente, a lamínula;
4. Analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x;
5. Esquematizar em aumento de 400x e 1.000x.
Observar:
• Os vários tipos de protozoários presentes na lâmina, sendo comuns o paramécio, a Euglena, entre outros;
• O citoplasma celular com suas estruturas e organelas, como: vesículas digestivas, vacúolo contrátil, cílios (no caso de protozoários ciliados), flagelos (no caso dos flagelados).
PRÁTICA N11
Célula eucariótica - levedura
As leveduras (Saccharomyces cerevisiae) são fungos unicelulares muito utilizados na produção de pães, pois pelo processo de fermentação alcoólica, metabolizam a glicose em etanol e gás carbônico (CO2), sendo este último responsável pelo crescimento dos pães. Podem se reproduzir sexuadamente ou assexuadamente por brotamento; sendo que, neste último caso, as células se dividem por mitose assimétrica. Caracteristicamente o envoltório nuclear se mantém intacto durante a mitose, e o fuso mitótico é formado dentro do núcleo. O brotamento, visível ao microscópio, se inicia inicia sua formação na fase G1 do período interfásico, crescendo, e conforme avança a divisão, se separa ao final do ciclo.
Descrever morfologia
Material: Fermento de pão.
Método:
1. Pegar uma porção de fermento para pão e dissolver em um pouco de água morna. Juntar açúcar comum e deixar descansar de 2 a 4 horas;
2. Pingar uma gota da suspensão sobre uma lâmina, e cobrir com lamínula;
3. Analisar ao microscópio em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x; 40x e 100x;
4. Preparar outra lâmina, porém, antes de colocar a lamínula, fixar o material passando a lâmina por uma chama ou chapa aquecida;
5. Corar com violeta de genciana por 5 minutos;
6. Lavar rapidamente em água corrente e cubrir com lamínula;
7. Analisar em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x; 100x;
8. Esquematizar em aumento de 1.000x.
Observar:
• Forma das leveduras do pão, que são células esféricas;
• Reprodução por brotamento.
PRÁTICA N12
Paramecium spp - organismo unicelular
O Paramecium é um protozoário ciliado, presente na água doce que contém vegetação em decomposição. Neste meio, o animal encontra seu alimento constituído principalmente por bactérias, pequenos protozoários, algas e fermentos. Os cílios servem tanto para locomoção, como para captura de alimento. Neste caso, o batimento ciliar produz uma corrente em direção a “boca celular” ou citóstoma. Uma vez no citóstoma o alimento é reunido na citofaringe e, por endocitose alcança o citoplasma celular. As vesículas de endocitose (fagossomas) fundem-se com endossomas, havendo a acidificação do lúmen e, posteriormente, há a fusão com os lisossomas. Estes liberam suas enzimas hidrolíticas que realizam a digestão intracelular. As pequenas moléculas, resultantes da digestão, são transportadas através da membrana da vesícula, sendo utilizadas no metabolismo celular. Material não digerido é eliminado por exocitose na região do citopígeo ou citoprocto.
Vivendo em um meio hipotônico a regulação osmótica é essencial para sua sobrevivência. A água em excesso é armazenada nos vacúolos contráteis. Estes se apresentam associados a filamentos do citoesqueleto e, quando estão cheios os filamentos se contraem, expulsando o líquido acumulado no vacúolo.
Material: Cultura pura de ciliados (Paramecium spp).
Método:
1. Em um Erlenmeyer preparar um meio de cultura contendo: 200 mL de água destilada, 0,25g de cloreto de sódio (NaCl), 01 colher de arroz com casca. Ferver bem;
2. Tampar o frasco com uma rolha de gaze e deixe esfriar;
3. Distribuir o meio em tubos de ensaio e tampá-los com uma rolha de gaze. Reserve;
4. Em um vidro de relógio colocar algumas gotas da cultura de protozoários preparadas na prática 06;
5. Levar o vidro de relógio para uma lupa e “pescar” alguns ciliados (Paramecium), com o auxílio de uma pipeta Pasteur;
6. Transferi-los para os tubos de ensaio com o meio de cultura. Tampar e deixar em repouso por aproximadamente dois dias, de modo que o tubo fique inclinado e em local que receba luz solar indireta;
7. Com uma pipeta colocar sobre a lâmina uma gota deste meio, cobrir com lamínula e analisar ao microscópio em aumentos crescentes. Esquematizar em aumento de 400x.
8. Preparar outra lâmina e colocar algumas gotas de lugol. Os cílios tornar-se-ão eriçados. Analisar em aumento de 400x e esquematizar.
9. Preparar novamente outra lâmina e acrescentar 1 gota de tinta nanquim. Neste caso, será possível observar os vacúolos contráteis; desenhar em aumento de 400x.
Observar:
• Movimento ciliar, estruturas e organelas dos paramécios;
• Cílios em grande quantidade distribuídos ao redor do corpo do animal, cuja visualização é facilitada ao preparar a lâmina como no item 8;
• Comportamento dos vacúolos contráteis, que ora se enchem de água e hora se esvaziam.
Paramecium spp - alimentação e digestão
1. Pegar 3g de fermento biológico amassado em graal;
2. Acrescentar 30 mg de vermelho congo e 10 mL de água destilada;
3. Misturar uniformemente em um béquer e ferver por 10 minutos;
4. Colocar uma gota desta solução sobre uma lâmina e acrescentar uma gota do meio de cultura (a mistura deve ficar rosa e não vermelha). Cobrir com lamínula e esquematizar.
Observar:
• Ação dos cílios na formação de correntes que direcionam o alimento para o citóstoma;
• Formação das vesículas de endocitose, cujo conteúdo apresenta-se em vermelho, devido às leveduras que foram coradas com o vermelho congo (corante vital), e ingeridas pelo animal;
• Verificar, depois de um tempo (15 a 30 minutos) a alteração na coloração destas vesículas, que passam de vermelho para azul. A alteração na coloração é o resultado do comportamento do corante frente a variação no pH das vesículas, que se torna ácido, após a fusão das vesículas de endocitose com os lisossomas.
PRÁTICA N13
Membrana plasmática
A membrana plasmática fornece individualidade à célula, delimitando os meios intra e extracelular. Seu modelo estrutural em mosaico-fluido “um mosaico de moléculas protéicas mergulhadas envoltas em uma bicamada fluida de lipídios”, confere à membrana características importantes e necessárias a sobrevivência da célula. A principal função da membrana é a de transporte de substâncias entre a célula e seu meio extracelular, e vice-versa. Este transporte só é possível, porque pois as membranas são semipermeáveis. Além disso, as membranas apresentam outras funções específicas, de acordo com o tipo celular, como: receptoras de sinais químicos, adesão, etc.
A estrutura da membrana plasmática só pode ser observada ao microscópio eletrônico. Entretanto, com o auxílio do microscópio de luz, pode ser obtida uma evidência indireta de sua existência, aplicando à célula soluções que façam com que a mesma reaja ao ambiente ao seu redor.
Osmose
Material: Allium cepa.
Método:
1. Retirar dois pedaços da epiderme inferior da cebola, e colocar cada um sobre uma lâmina;
2. Pingar algumas gotas de água sobre uma das lâmina, e na outra lâmina pingar gotas de solução de NaCl a 3,0%.
3. Cobrir com lamínula e retirar o excesso de líquido com papel absorvente;
4. Analisar em aumentos crescentes até 400x;
5. Esquematizar neste aumento.
Observar:
• O comportamento da membrana plasmática nas diferentes soluções. Verificar que na lâmina com o cloreto de sódio o citoplasma se separa da parede celular, devido ao desprendimento de sua membrana plasmática, que responde às diferenças de osmolaridade.
PRÁTICA N14
Membrana plasmática
O SANGUE É COMPOSTO
Material: Sangue.
Método:
1. Retirar três gotas de sangue do dedo indicador e transferir para três lâminas limpas;
2. Em uma das lâminas pingar uma gota de NaCl 0,4%, homogeneizar e colocar uma lamínula, em ângulo de 45° para não formar bolhas;
3. Em outra lâmina pingar uma gota de NaCl 0,9%, homogeneizar e colocar uma lamínula;
4. Na terceira lâmina pingar uma gota de NaCl 1,5%, homogeneizar e colocar uma lamínula;
5. Analisar em aumentos crescentes até 1.000x;
6. Esquematizar neste aumento.
Observar:
•
PRÁTICA N15
CROMOPLASTOS
Os cromoplastos acumulam pigmentos de várias naturezas e são denominados segundo estes. Por exemplo os cloroplastos são plastos cujo pigmento é a clorofila (chlorós = verde), nos eritroplastos o pigmento é a eritrofila (erythrós = vermelho), e nos xantoplastos o pigmento é a xantofila (xantós = amarelo). Os pigmentos são responsáveis pela absorção da energia luminosa para a sua transformação em energia química.................... Eles são importantes para a vida autotrófica das plantas.
Material: Epiderme inferior da folha de samambaia.
Método:
1. Retirar dois pedaços, pequenos e finos, da epiderme inferior da folha;
2. Colocar cada pedaço em uma lâmina específica;
3. Adicionar em uma das lâminas algumas gotas de água e na outra algumas gotas de lugol;
4. Cobrir com lamínula e retirar o excesso de líquido com papel absorvente;
5. Analisar ao microscópio em aumentos progressivos até o aumento final de 400x;
6. Esquematizar neste aumento.
Observar:
• Cloroplasto
• estômatos
Material: Polpa de tomate.
Método:
1. Raspar a polpa de um tomate maduro e colocar o material com água sobre a lâmina;
2. Cobrir com lamínula, retirando-se o excesso de líquido com papel absorvente;
3. Analisar o material nas objetivas de 10X e 400X;
4. Esquematizar nestes aumentos.
Observar:
• Morfologia das células da polpa do tomate, no aumento menor;
• Eritoplastos contendo licopeno ??? (carotenóide).
Material: Polpa de pimentão amarelo.
Método:
1. Cortar uma fatia de pimentão amarelo com gilete. A espessura do corte deve ser a mais fina possível;
5. Colocar o material sobre a lâmina, contendo uma gota de água;
6. Cobrir com lamínula, retirando-se o excesso de água com papel absorvente;
7. Analisar o material nas objetivas de 10X e 400X;
8. Esquematizar nestes aumentos.
Observar:
• Morfologia das células da polpa do pimentão, no aumento menor;
• Xantoplastos contendo os pigmentos de xantofila.
PRÁTICA N16
Leucoplastos
Os leucoplastos, plastos sem cor, não realizam a fotossíntese. Eles são um pouco maiores que os cromoplastos ???. No seu lúmen são acumulados os compostos sintetizados pela célula, que podem ser: amido, óleos e proteínas, dando então a denominação, respectiva, de amiloplastos, oleoplastos e proteoplastos.
Material: Batata inglesa (Tuberculus tuberosa).
Método:
1. Cortar duas fatias bem finas da batata com gilete;
2. Transferir uma fatia para uma lâmina contendo água, e a outra para uma lâmina contendo algumas gotas de lugol a ??% por aproximadamente 3 minutos;
3. Cobrir com lamínula, retirando o excesso de líquido com papel absorvente;
4. Analisar nas objetivas de 4x, 10x e 40x;
5. Esquematizar no aumento de 400X.
Observar:
• A morfologia das células e os amiloplastos no citoplasma, sem o corante e, posteriormente, com o corante;
PRÁTICA N17
Mitocôndrias
As mitocôndrias estão presentes no citoplasma das células eucarióticas aeróbicas, onde realizam a fosforilação oxidativa. O número de mitocôndrias no citoplasma celular varia de acordo com o tipo celular e se relaciona com sua atividade metabólica. Assim, quanto maior a demanda de energia, maior é a síntese de ATP (adenosina trifosfato) e, conseqüentemente, maior é o seu número de mitocôndrias. As mitocôndrias são organelas plásticas e se movimentam no citoplasma celular dirigindo-se, freqüentemente, aos locais onde há maior demando energética. A mitocôndria apresenta 1-3 µm de comprimento e 0,5-1 µm de largura.
Material: Sangue.
Método:
1. Colocar uma gota de Verde Janus a 0,7% diluído em álcool 70% (misturar 100 mL de álcool 70% em 0,7 gramas de corante), sobre uma lâmina bem limpa e esperar secar um pouco, não completamente;
2. Após higienização, furar a polpa do dedo anelar com uma lanceta;
3. Acrescentar uma gota de sangue sobre o resíduo do corante na lâmina, misturando bem com a borda da lamínula;
4. Colocar a lamínula;
5. analisar em aumento final de 1.000x.
Observar:
• Mitocôndrias, que aparecem como pontos diminutos no citoplasma do leucócito.
verificar no Atlas de histologia esta prática.
PRÁTICA N18
Grânulos citoplasmáticos – movimento intracelular
Uma das características mais marcantes dos seres vivos é a sua capacidade de se mover. Os movimentos que os sistemas vivos executam derivam de movimentos dentro das células ou de grupos de células. O movimento pode ser visível (animais), ou lento e restrito (plantas). Alguns movimentos levam à modificação na forma das células: movimento pela formação de pseudópodes, nas amebas e nos macrófagos; movimento ciliar, no Paramecium; movimento flagelar, na Euglena; movimento dos cromossomos na divisão celular; e o movimento das células musculares. Outros movimentos não levam à modificação na forma da célula, como as correntes citoplasmáticas, o transporte intracelular, e o movimento de organelas.
O transporte intracelular é importante em muitos aspectos da fisiologia celular
, como o transporte de vesículas melanóforos
Estes movimentos são proporcionados por um complexo conjunto de proteínas fibrosas e motoras, entrelaçadas em um arranjo tridimensional característico no citoplasma celular. Estas proteínas formam um esqueleto interno, endoesqueleto ou citoesqueleto. A função do citoesqueleto está relacionada à determinação do formato celular, estabilizando e mantendo a arquitetura subcelular. Além disso, esta estrutura permite flexibilidade e mobilidade de organelas e estruturas celulares, essenciais ao movimento, crescimento e outros processos vitais. Por isso, o citoesqueleto pode ser também denominado, de citomusculatura. Os constituintes básicos do citoesqueleto são os microtúbulos, filamentos de actina, filamentos intermediários, e as proteínas motoras.
Material: escamas de peixe
Método:
1. Manter peixes vivos (tilápia) por 2 a 3 dias em um aquário com água preferencialmente sem cloro;
2. Despregar, com um bisturi, algumas escamas do peixe, raspando a pele no sentido da cauda para a cabeça;
3. Colocar as escamas em uma placa de Petri contendo NaCl a 0,6%, até o momento de transferi-las para as lâminas;
4. Pegar uma escama cuidadosamente e colocar sobre a lâmina, contendo 1 gota de NaCl a 0,6%, e cobrir com lamínula;
5. Aquecer suavemente a lâmina na chama de uma lamparinaou chapa aquecedora;
6. Analisar ao microscópio em menor aumento (objetiva de 4X), selecionando a região da escama com melanóforos abundantes e bem conservados.
7. Esquematizar nos aumentos de 400x e 1.000x;
8. Pegar outra escama e repetir o procedimento do item 4; antes de analisar ao microscópio, como nos itens 6 e 7, colocar a lâmina por cerca de 1 hora sobre gelo.
Observar:
• Comportamento dos melanóforos quando submetidos ao calor e ao frio.
incluir lâminas permanentes de mm estriado esquelético??
PRÁTICA N19
Cílios e flagelos - Movimentos celulares
Cílios e flagelos são projeções celulares, filiformes, dotadas de motilidade própria, cujos número e tamanho variam de acordo com o organismo e a célula. Quando são escassos e longos, são denominados de flagelos, e quando são numerosos e curtos, cílios. Tanto os cílios quanto os flagelos são formados por feixes de microtúbulos que se organizam em uma estrutura denominada complexo 9+2 ou axonema, onde se associam várias outras proteínas, formando um sistema que possibilita o movimento.
Funções dos c&f e exemplos onde são encontrados
Depois da segunda divisão meiótica masculina, cada espermátide sofre diferenciação, formando os espermatozóides, que se locomovem por meio de ondas de contração que se iniciam na base da estrutura.
Material: Espermatozóides.
Método:
1. Pingar uma gota de solução fisiológica contendo espermatozóides vivos, que podem ser de humanos ou animais, sobre uma lâmina;
2. Cobrir com lamínula;
3. Analisar ao microscópio em aumentos progressivos até 1.000x;
4. Desenhar neste aumento.
Observar:
• Morfologia dos espermatozóides identificando as regiões da cabeça, mais dilatada, da cauda, longa, formada pelo flagelo, e do colo, localizado entre a cabeça e a cauda.
incluir protozoários ciliados e flagelados
PRÁTICA N20
Núcleo células mononucleada e binucleada
Uma das principais características da célula eucarionte é a presença do núcleo, que apresenta duas funções principais: armazenar o material genético – DNA – e coordenar as atividades do metabolismo celular. O núcleo é, em geral, único, mas algumas células apresentam dois ou mais. Como exemplos: a célula hepática, que pode apresentar até dois núcleos, a célula muscular estriada esquelética, que apresenta várias dezenas de núcleos; os osteoclastos, célula do tecido ósseo, que apresenta 50 ou mais núcleos. Ao microscópio de luz o núcleo tem contorno nítido. sendo o seu interior preenchido por elementos figurados??. Dentre os elementos distinguem-se o nucléolo e a cromatina. A presença do núcleo é essencial para o metabolismo celular, visto que a maior parte da informação genética (DNA), está contida nele, gerando constantemente todo RNA necessário para a síntese protéica.
Material: "imprint" decalque de fígado bovino.
Método:
1. Pegue um pedaço de fígado fresco de boi. Com uma lâmina toque suavemente na superfície do mesmo, fazendo um "imprint" de suas células sobre a lâmina. Deixe secar;
2. Core o material com azul de metileno ou orceína acética, pingando uma gota do corante sobre a lâmina, deixe agir por 5 minutos;
3. Cubra com lamínula em ângulo de 45 para evitar a formação de bolhas;
4. Retire o excesso do corante com auxílio de papel absorvente, mantendo a lamínula fixa - esta não deve ficar escorregando sobre a lâmina;
5. Observe ao microscópio em aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 04x, 10x, 40x e 100x;
6. Desenhe.
Observações:
1. Citoplasma; Núcleo (1 ou 2)
PRÁTICA N21
Núcleo de Células sangüíneas célula anucleada e polimorfonucleada
O sangue Células sem núcleo têm vida limitada e atividade metabólica restrita, como exemplo, podemos citar as hemácias de mamíferos. Estas células sanguíneas são semelhantes umas às outras quando vistas ao microscópio de luz. Já as células sanguíneas brancas diferem entre si e podem ser agrupadas em duas categorias principais, conforme a sua morfologia: granulócitos, e agranulócitos.
Material: Sangue humano.
Objetivo: Identificar células anucleadas (hemáceas) e células polimorfonucleadas (leucócitos).
Método:
1. Limpar a ponta do dedo mínimo com um pedaço de algodão embebido em álcool iodado;
2. Espetar o dedo com uma lanceta descartável;
3. Colocar uma gota de sangue sobre uma lâmina;
4. Com a ajuda de outra lâmina posicionada sobre a primeira em ângulo de 45, deixar que esta toque a gota de sangue arrastando-a e espalhando-a sobre a primeira lâmina formando, assim, um esfregaço;
5. Agitar rapidamente a lâmina com o esfregaço para secar;
6. Corar o material mergulhando a lâmina, por 5 minutos, em uma cubeta contendo azul de metileno;
7. Enxágüe a lâmina em um fio de água de torneira;
8. Deixe secar;
9. Analisar ao microscópio nas objetivas de 40x e 100x;
10. Desenhar ou esquematizar? no aumento de 1.000X.
Usar Leishmann
Observar:
• Leucócitos, com núcleos de várias formas corados em roxo;
• Hemáceas, citoplasma corado em rosa e núcleo ausente;
• Plaquetas, pequenos fragmentos celulares dispersos na lâmina.
Nucléolo - prática n22
O nucléolo é um organóide celular encontrado no núcleo das células interfásicas, constituído pelo segmento de DNA com genes para a transcrição do RNA ribossômico, o que foi dado o nome de região do organizador nucleolar (Nucleolar Organizer Region), abreviadamente “NOR”; pelos RNAs ribossômicos; e pelas proteínas nucleolina e fibrilarina.
O número de cromossomos com NOR pode corresponder ao número de nucléolos; assim, uma célula pode apresentar um número de nucléolos que corresponde ao seu número de NOR. Contudo, freqüentemente, os segmentos de DNA com NOR se aproximam, formando um número de nucléolos que corresponde ao número de NOR que se aproximaram e organizaram um nucléolo em conjunto. Por exemplo, a espécie humana apresenta 5 cromossomos com NOR, os cromossomos acrocêntricos 13, 14, 15, 21 e 22; assim, se nenhum outro fenômeno estiver envolvido, podem ser visualizados nos núcleos celulares da espécie humana 1 a 5 nucléolos.
O nucléolo é uma estrutura dinâmica, que se movimenta e altera seu volume dentro do núcleo; além disso, sua estrutura e fisiologia também se alteram durante o ciclo celular. O comportamento cíclico do nucléolo envolve fases em que o mesmo se encontra organizado, em desorganização, ausente, e em reorganização. Este ciclo nucleolar pode ser analisado em microscopia de luz pela técnica de coloração com o nitrato de prata, uma vez que as proteínas nucleolares são argirofílicas?
Material: Allium cepa
Objetivo: Analisar o comportamento do nucléolo nos diversos estágios da mitose e na interfase
Método:
1. Selecionar cebolas de tamanho médio/pequeno e destaque as raízes velhas. Encaixe as cebolas em copos contendo água de modo que apenas a base da cebola fique em contato com a água. Providencie copos escuros ou recobertos com papel alumínio;
2. Retire com uma pinça as raízes crescidas (de tamanho apropriado) e coloque-as num tubo de ensaio contendo a orceína-acética;
1. Colocar cebolas para germinar e fixar as raízes, que tenham 1 a 2 cm, em formol a 10% e hidroquinona a 1%, durante 1 a 2 horas à temperatura ambiente;
2. Lavar com água destilada durante 10 minutos, por 3 vezes;
3. Colocar as raízes em um frasco escuro contendo nitrato de prata (AgNO3) a 2% (para o preparo de 100 mL de solução adicione 2 gramas de AgNO3 em 100 mL de água destilada);
4. Deixar em estufa a 70°C, durante 10 a 15 horas, ou por toda à noite (overnight);
5. Lavar em água destilada durante 10 minutos, por 3 vezes;
6. Colocar novamente na solução fixadora nova (item 1), a temperatura ambiente, por 1 a 2 horas;
7. Retirar a região meristemática (que normalmente apresenta coloração mais forte), colocar entre lâmina e lamínula, e proceder ao esmagamento;
8. Para tanto, pegar a ponta de um lápis, ou algo semelhante, e com golpes repetidos, mas suaves, espalhar o material, executando movimentos circulares centrípetos sobre a lamínula e na região em que o material está localizado;
9. Com um papel de filtro, retirar o excesso de corante pressionando levemente o papel com o polegar sobre a lamínula;
10. Com o mesmo papel ou outro, pressionar fortemente o material, usando os dois polegares para efetuar o esmagamento final, cuidando para que a lamínula não se mova. Se desejar, vede lâmina e lamínula com esmalte incolor;
11. Analisar em aumentos crescentes e desenhar em aumento final de 400x ou 1.000x.
Observar:
• Células em interfase e em diferentes estágios da mitose {prófase, metáfase, anáfase e telófase}. Cabe ressaltar, que o nitrato de prata apresenta afinidade pelas proteínas nucleolares; assim, nem sempre é possível observar as fases de metáfase e anáfase, pois nestas fases as proteínas encontram-se dispersas no citoplasma da célula em divisão;
• Nucléolo organizado na interfase, que se apresenta como uma estrutura esférica ou ovalada, de coloração marrom. O número de nucléolos no núcleo interfásico varia de 1 a 5;
• Nucléolo em desorganização na prófase, sua estrutura começa a se fragmentar;
• Nucléolo ausente na metáfase e anáfase;
• Nucléolo em organização na telófase, pequenas estruturas de coloração marrom aparecem no núcleo, que também se reorganiza nesta fase. Estas estruturas são denominadas corpos pré-nucleolares.
PRÁTICA N23
Cromossomos politênicos
Os cromossomos politênicos podem ser facilmente observados em vários tecidos de dípteros em fase larval. A glândula salivar é o local onde eles apresentam-se mais desenvolvidos. Em geral, estes cromossomos têm tamanho, aproximadamente, 100 vezes maior que os cromossomos comuns. Essa diferença de tamanho se deve ao fato de que o DNA está pouco condensado (espessura de solenóide). Além disso, cada cromossomo é formado por várias cópias de si mesmo em um processo denominado de endomitose, o qual se iniciou com o pareamento dos cromossomos homólogos. Neste processo, ocorre vários ciclos de duplicação do DNA sem que haja divisão celular. A espessura do cromossomo depende basicamente do número de endomitoses que ele sofreu.
Estes cromossomos apresentam muitas bandas (ou faixas) transversais, que podem ter coloração clara ou escura. Esta diferença se deve a quantidade de nucleoproteína e ao grau de enovelamento do filamento de DNA nesta região (cromômeros). Durante o desenvolvimento da larva, algumas destas bandas mostram-se mais dilatadas e podem ser facilmente identificadas ao microscópio. Estas dilatações são conhecidas como “puffs”. O padrão de “puffs” de um cromossomo varia de acordo com o tecido e com o estágio de maturação da larva. Ou seja, faixas que no início da maturação larval estavam mais condensadas podem tornar-se mais dilatadas e originar um “puff”, em outro tecido ou em estágio mais avançado de desenvolvimento larval. Estas modificações foram consideradas como manifestações morfológicas dos genes ativados. Observa-se entretanto que as células portadoras de cromossomos politênicos são incapazes de se dividirem. Portanto só produzem cromossomos politênicos aquelas células do corpo larval que não estão destinadas a produzir estruturas do inseto adulto durante a metamorfose.
MATERIAL: glândula salivar de Drosophila melanogaster (“mosca das frutas”).
MÉTODO:
1. Transfira a larva do inseto para uma lâmina contendo uma gota de solução fisiológica;
2. Prenda a parte posterior da larva com o auxílio de um estilete. Com outro estilete, espete a cabeça e puxe de modo que os órgãos internos sejam exteriorizados;
3. Duas glândulas aparecerão, uma de cada lado, na parte inferior da cabeça. Estas glândulas possuem formato aproximado de pequenas bexigas;
4. Transferir a glândula para outra lâmina eliminando restos de gordura e demais tecidos que possam estar ao redor da mesma;
5. Cubra o material com uma gota de orceína acética e deixe corar por 5 minutos. Aquecer brevemente em chama de lamparina;
6. Coloque a lamínula sobre o material e proceder ao esmagamento. Lute a lâmina com esmalte incolor. Observe os padrões de bandas e interbandas característicos.
PRÁTICA N 24
Cromatina sexual ou corpúsculo de Barr
A observação de que algumas regiões cromossômicas mantinham-se mais coradas que as demais no núcleo interfásico, levou, em 1928, o citogeneticista alemão, Emil Heitz a demonstrar que alguns seguimentos cromossômicos mantinham-se condensados durante todo o ciclo celular. Isto demonstrava a existência de dois tipos de cromatina: heterocromatina (mais condensada) e eucromatina (apresentava ciclo de condensação - descondensação). Uma das principais características da heterocromatina é a ausência da atividade gênica.
Há dois tipos de heterocromatina: heterocromatina constitutiva (com características particulares e aparecendo em ambos os homólogos) e a facultativa. Um exemplo clássico de heterocromatina facultativa é o corpúsculo de Barr, observado nas células de mamíferos do sexo feminino. Mary Lyon propôs uma hipótese para explicar por que nas células femininas há apenas um X ativo. Segundo a hipótese de Lyon, a inativação de um cromossomo X garantiria um equilíbrio entre a quantidade de genes ativos em ambos os sexos.
MATERIAL: células da mucosa bucal
MÉTODO:
1. Lave a boca com água;
2. Colete células da mucosa bucal por meio de raspagem com auxílio de um palito de sorvete, espalhe suavemente sobre a lâmina fazendo um pequeno esfregaço;
3. Mergulhe a lâmina em álcool a 95 %, por 30 minutos;
4. Transfira para o álcool absoluto (3 minutos) e em seguida para álcool a 70% (5 minutos);
5. Core com solução de fucsina a 10% (5 minutos) e transfira para álcool a 95% (10 minutos). Enxágüe com água;
6. Observe em aumentos crescentes até 1.000x e esquematize.
PRÁTICA N25
Divisão celular – mitose
Todos os organismos vivos são células ou agregados de células e, todas as células que os constituem são descendentes de um antecessor celular comum por EVOLUÇÃO. A célula é uma unidade envolta por membrana contendo enzimas e outros elementos, capaz de efetuar seu metabolismo e reprodução independente. Toda as células possuem uma maquinaria hereditária, na qual o DNA é usado para armazenar a informação. Como unidades altamente organizadas as células estão sujeitas a desgaste e acidentes e, para o organismo continuar vivendo, devem gerar novas células na mesma proporção em que são perdidas, por isso, a DIVISÃO CELULAR é central para a vida de todos os organismos. Entende-se por MITOSE, o processo de divisão de uma célula formando duas novas genética e cromossomicamente idênticas e, portanto, o número de cromossomos da espécie biológica é mantido constante. Em seres unicelulares a divisão se confunde com a própria reprodução. Nos pluricelulares, a divisão permite o crescimento e o desenvolvimento do organismo, que depende do crescimento e da multiplicação de suas células, atuando nos fenômenos de reparação e renovação tecidual.
Os melhores materiais para a observação da mitose são os tecidos em fase de crescimento, tais como as extremidades das raízes das plantas e os brotos das folhas. A região meristemática das raízes de cebola (Allium cepa) constitui um ótimo material para observação e reconhecimento das fases da mitose. Os bulbos de cebola são colocados para germinar em recipientes escuros, com água de torneira, permitindo que a parte inferior do bulbo toque na água. Antes, porém, os catáfilos secos devem ser removidos e, com o auxílio de uma pinça, as raízes velhas devem ser eliminadas. A germinação pode ser efetuada a temperatura ambiente ou a 25C durante 3 dias ou o tempo suficiente para que as raízes adquiram um comprimento de cerca de 1 ou 2 cm, tamanho necessário para que exista um equilíbrio celular dinâmico com relação ao ciclo celular.
Material: Allium cepa
Método:
3. Selecione cebolas de tamanho médio/pequeno e destaque as raízes velhas. Encaixe as cebolas em copos contendo água de modo que apenas a base da cebola fique em contato com a água. Providencie copos escuros ou recobertos com papel alumínio;
4. Retire com uma pinça as raízes crescidas (de tamanho apropriado) e coloque-as num tubo de ensaio contendo a orceína-acética;
5. Com pinças apropriadas (madeira) prenda o tubo de ensaio e aqueça o material, fazendo movimentos circulares sobre uma chama, até que se inicie a saída de vapores. Cuidado, não deixar ferver. Deixe esfriar e repita a operação por mais duas vezes, sempre esperando o resfriamento antes de aquecer novamente;
6. Com uma pinça retire uma ou duas raízes do tubo de ensaio e coloque-as sobre uma lâmina. Retire, com o auxílio de uma gilete nova, a região da coifa e a de crescimento, deixando apenas a região meristemática (coloração mais forte);
7. Sobre a região meristemática, coloque uma gota de orceína-acética e com uma gilete recorte delicadamente o material – coloque sobre o mesmo, uma lamínula para proceder ao esmagamento;
8. Com a ponta de um lápis, ou algo semelhante, espalhe o material mediante golpes repetidos, executando movimentos circulares centrípetos sobre a lamínula e na região em que o material está localizado;
9. Com um papel de filtro, retire o excesso de corante pressionando levemente o papel com o polegar sobre a lamínula;
10. Com o mesmo papel ou outro, pressione fortemente o material como os dois polegares para efetuar o esmagamento final, cuidando para que a lamínula não se mova. Se desejar, vede com esmalte incolor;
11. Observar em aumentos crescentes os tipos celulares no microscópio: Intérfase, Prófase, Metáfase, Anáfase e Telófase. Esquematize as fases do ciclo celular.
PRÁTICA N 26
Divisão celular - meiose
Em organismos unicelulares a divisão mitótica representa, freqüentemente, a própria reprodução da espécie. Este tipo de reprodução assexuada produz organismos geneticamente iguais. Na reprodução sexuada, por sua vez, há a mistura de genomas de dois indivíduos, produzindo um indivíduo que difere geneticamente de seus parentais.
Com exceção dos cromossomos que determinam o sexo, um núcleo de célula diplóide (2n) contém duas versões similares de cada cromossomo autossômico que são denominados de homólogos. Em cada indivíduo, um dos homólogos foi “doado” pela mãe e o outro pelo pai. A meiose (meioum = diminuir) ocorre nas células reprodutoras masculinas e femininas. Este processo envolve duas divisões celulares com somente uma fase de duplicação do DNA. No final da meiose, as células possuem apenas a metade do número inicial de cromossomos, ou seja, somente um cromossomo no lugar de um par de homólogos. Este fenômeno explica o fato de que o número de cromossomos da espécie normalmente não é alterado, embora haja fusão de duas células para formação de um zigoto. Assim, são formadas células genética e cromossomicamente diferentes da célula que iniciou o processo de divisão.
MATERIAL: florescência masculina de milho
MÉTODO:
1. Fixe os botões florais em Carnoy (3 álcool : 1 ácido acético), durante um período que pode varias de 12 a 24 horas;
2. Transfira para álcool a 70% durante 24 horas;
3. Remova anteras e coloque-as em lâmina com 1 gota do corante carmim propriônico ( 45 mL ácido propriônico + água destilada 55 mL + carmin 1 g);
4. Corte as anteras e extraia os microsporócitos com auxílio de uma pinça;
5. Remova os restos das anteras e passe “ferrinho”até escurecer um pouco o corante (provavelmente o ferro promova algum tipo de oxidação no material);
6. Coloque a lamínula e aqueça brevemente em chama de lamparina;
7. Proceda ao esmagamento do material contido entre lâmina e lamínula. Para isso envolva-os entre duas folhas de papel de filtro dobrado. Pressione com o dedo polegar sobre este material em superfície plana, evitando que o mesmo se quebre;
8. Observe ao microscópio;
9. Se desejar tornar a lâmina permanente, descole a lamínula com ácido acético a 45%, deixando-a invertida e mergulhada nesta solução em um vidro de relógio até que a lamínula se desprenda. Deixe secar e monte em resina sintética;
10. Observe em aumentos crescentes até 1.000x e esquematize as fases nas várias lâminas produzidas em aula.
Obs.: a fase de leptóteno não é observada.
zigóteno paquíteno diplóteno
diacenese metáfase I anáfase I
telófase I metáfase II anáfase II
telófase II tétrade grãos de pólen
PRÁTICA N27
Extração de DNA
Várias técnicas de extração de DNA, tanto em tecidos animais quanto vegetais, têm sido amplamente descritas na literatura especializada. O protocolo descrito nesta prática é bastante simples e deve ser utilizado apenas para fins didáticos.
No momento em que a cebola é picada em pequenos fragmentos, rompe-se um grande número de células facilitando a liberação de seus núcleos. O detergente solubiliza as membranas e auxilia na desestruturação dos cromossomos, por afetar a conformação nativa das proteínas ligadas a ele. Isto faz com que o DNA fique “desempacotado”, soltando-se na solução. O sal é utilizado na solubilização e por sua ação detergente. Além disso, é necessário também, no momento em que se adiciona o etanol gelado; havendo a desidratação do DNA, tornando-o visível (assemelha-se a um pequeno chumaço de algodão, separado do restante da solução).
Material: Allium cepa
Método:
1. Pegue uma cebola grande (250 gramas) e pique-a em pedaços quadrados de cerca de 5 milímetros;
2. Misture em um béquer: 10 mL de detergente com 03 gramas de sal e acrescente água em quantidade suficiente para completar 100 mL de solução. Mexer bem;
3. Junte a esta solução a cebola picada e leve para aquecer em banho-maria a 60 C por 15 minutos;
4. Em seguida, resfrie rapidamente em uma bacia com gelo, mexa-a bem;
5. Coe a mistura em um filtro para café; jogue fora o “bagaço” e coloque o líquido resultante em um tubo de ensaio;
6. Despeje delicadamente etanol a 95% (gelado) no tubo de ensaio;
7. O DNA “sobe” para o etanol, no qual não é solúvel, ficando preservado;
8. Esquematizar.
UTILIZAÇÃO DO DNA
Por meio de técnicas mais apropriadas, o DNA extraído de origem animal, vegetal ou humano, pode ser estocado no “freezer” por vários meses. Sua utilização é bastante ampla e depende basicamente da estrutura que o laboratório dispõe e dos objetivos de cada pesquisador.
De maneira bastante ampla, podemos citar algumas áreas nas quais o DNA vem sendo utilizado: genética animal, marcadores de características de interesse econômico, teste de paternidade para controle de “pedigree”, animais transgênicos, estudos de genética populacional, etc.; genética vegetal, marcadores de características de interesse econômico, plantas transgênicas, etc.; genética humana, teste de paternidade, medicina forense, diagnóstico pré-natal de doenças genéticas, diagnóstico de doenças infecciosas, etc. A lista de possibilidades de utilização do DNA é bastante grande e a cada dia que passa, novos protocolos são sendo desenvolvidos.
Exemplo prático. Alguns testes de DNA estão sendo utilizados para auxiliar na resolução de casos de crime ou na disputa de paternidade. Isto se deve ao fato de que cada indivíduo (exceto gêmeos univitelínicos) possui um conjunto de genes que não será o mesmo em nenhum outro.
Para traçar um perfil molecular é necessário encontrar as diferenças no DNA de cada um. O exame de DNA revela diferenças entre os genótipos dos indivíduos, as quais, nem sempre, são observadas no fenótipo. As regiões hipervariáveis do DNA, muito usadas na identificação individual, são pequenas seqüências repetidas em tandem, também chamadas de minissatélites ou ainda VNTRs (Variable Number of Tandem Repeat). A variação no DNA, neste caso, se expressa pelas diferenças observadas no número das seqüências repetidas. Assim, o número de seqüências repetidas em cada loco VNTR é altamente variável entre os indivíduos.
Para melhor compreensão, suponha que uma mulher foi brutalmente assassinada. Os peritos recuperaram no corpo da vítima uma amostra de sêmen que foi levado para análise de DNA. Três homens suspeitos foram presos e foram também submetidos a este teste.
A figura abaixo mostra um esquema representativo de um gel de eletroforese, onde um padrão de bandas de DNA é evidenciado. Nas canaletas 1, 2 e 3, foram depositadas as amostras de DNA dos três suspeitos. Na canaleta 4 foi depositada a amostra de DNA obtido do sêmen. Após aplicar uma corrente elétrica, o DNA, em cada canaleta, vai migrar para o pólo positivo (parte inferior do gel). Os fragmentos migrarão para este pólo sendo que os fragmentos menores o farão mais rapidamente.
Canaletas que apresentam o mesmo padrão de bandeamento (2 e 4) indicam que os dois materiais biológicos (sangue e sêmen), pertencem à mesma pessoa.
CORANTES E REAGENTES
ÁGUA SULFUROSA
HCl 1N 10 mL
Bissulfito de sódio a 10% 10 mL
Água destilada 200 mL
Deve ser preparado na hora da utilização.
AZUL DE METILENO (aquoso)
Azul de metileno 1g
Água destilada 100 mL
CARMIM PROPIÔNICO
Ácido propiônico 45 mL
Água destilada 55 mL
Carmim 1g
CLORETO DE ZINCO IODADO
ZnCl2 20g
Iodo 1,3g
Iodeto de potássio 6,5g
Água destilada 14 mL
Preparo: dissolva o iodo em uma parte da água destilada e, logo em seguida, o iodeto de potássio. Acrescente o restante da água e após, o cloreto de zinco.
CRISTAL VIOLETA ou VIOLETA DE GENCIANA
Violeta de Genciana 5g
Álcool 95% 50 mL
Fenol fundido 10g
Água destilada 500 mL
Preparo: triture a violeta de Genciana e acrescente o álcool, o fenol e 250 mL de água. Depois de dissolvido, complete para 500 mL.
EOSINA
Eosina Y, solúvel em água 1g
Água destilada 100 mL
FUCSINA FENICADA
Fucsina básica 0,3g
Álcool 95% 10 mL
Fenol fundido 5 mL ou 5 g
Água destilada 95 mL
HEMATOXILINA
Hematoxilina 2,5g
Àlcool 100% 25 mL
Alúmen de amônio ou de potássio 50 g
Água destilada 500 mL
Óxido vermelho de mercúrio 1,25 g
Ácido acético 20 mL
Preparo: dissolva a hematoxilina no álcool e o alúmen na água previamente aquecida; misture as duas soluções e aqueça até a fervura; adicione o óxido de mercúrio e resfrie (mergulhe o frasco na água fria); depois de fria adicione o ácido acético e filtre.
HIDROQUINONA (1%)
Hidroquinona 1g
Água destilada 100 mL
LUGOL
Iodo 1g
Iodeto de potássio 2g
Água destilada 300 mL
Preparo: Dissolva o iodeto de potássio na água destilada. Nesta solução, dissolva o iodo cristalizado.
Metabissulfito de sódio ou potássio a 10%; HCl 1N; água destilada (1:1:18)
NITRATO DE PRATA (AgNO3 - 2%)
AgNO3 2g
Água destilada 100 mL
Obs.: conservar esta solução na geladeira em frasco escuro.
ORCEÍNA ACÉTICA
Ácido acético 55 mL
Água destilada 45 mL
Orceína 2g
Preparo: aqueça a água até ebulição e então adicione a orceína e deixe ferver por mais 7 a 10 minutos. Filtre após o seu resfriamento.
REATIVO DE SCHIFF
Fucsina básica 1g
Metabissulfito de sódio 2g
Água destilada 200 mL
Ácido clorídrico concentrado 1,2 mL
Carvão vegetal 2g
Preparo: ferva a água destilada e coloque a fucsina vagarosamente. Agite bem e retorne ao fogo. Retire assim que entrar em ebulição e deixe esfriar a 50oC. Coloque o metabissulfito e dilua bem. Deixe esfriar até 30oC antes de acrescentar o ácido clorídrico (HCl). Deixe na geladeira por uma noite e, no dia seguinte, acrescente o carvão vegetal. Filtre esta solução e guarde na geladeira em frasco escuro.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, k.; WATSON, J.D. Biologia molecular da célula. 3ª ed. Editora Artes Médicas, São Paulo, 1997. 1362 p.
FARAH, S.B. DNA Segredos e Mistérios. 1ª ed. Editora Sarvier, São Paulo, S.P., 1997. 276 p.
GUERRA, M. Introdução a Citogenética Geral. Editora Guanabara S.A., Rio de Janeiro, R.J., 1988. 142 p.
JORDÃO, B.Q.J.; ANDRADE, C.G.T.J.; RUAS, C.F.; CÓLUS, I.M.S.; BUIM, M.E. Práticas de Biologia Celular. 1ª ed. Editora da Universidade Estadual de Londrina, Londrina-P.R., 1998. 163p.
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Biologia Celular e Molecular. 7ª ed. Editora Guanabara Koogan , Rio de Janeiro-R.J., 2000. 339p.
MELLO, M.L.S.; VIDAL, B.C.. Práticas de biologia Celular. 1ª ed. Editora Edgard Blücher Ltda. e Fundação de desenvolvimento da UNICAMP, São Paulo, 1980. 102p.
POLIZELI, M.L.T.M. Manual Prático de Biologia Celular. Editora Holos Ltda.-ME. Ribeirão Preto, SP., 1999. 72p.
ROBERTIS, E.D.P.; ROBERTIS, .E.M.F. Jr. Bases da Biologia Celular e Molecular. 2ª ed. Editora Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro-R.J., 1993. 307p.
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